已免疫羊駝的免疫系統(tǒng)存在 “記憶殘留”—— 針對既往抗原的記憶 B 細胞會優(yōu)先激活，干擾新抗原的特異性免疫應答，導致表位識別偏移與交叉反應，且風險因 “既往抗原未知” 而進一步放大。
羊駝免疫系統(tǒng)對新抗原的表位識別會受既往免疫 “訓練” 的影響，優(yōu)先針對非關鍵表位產(chǎn)生抗體，而非治療或檢測所需的核心表位。例如：
- 在新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）免疫中，零免疫背景羊駝產(chǎn)生的 VHH 中，60%-70% 靶向 RBD 區(qū)（中和病毒的關鍵表位）；而經(jīng)其他冠狀病毒（如 MERS）免疫的羊駝，僅 20%-30% 的 VHH 靶向 RBD 區(qū)，其余多結合 S2 亞基（非中和表位），導致篩選出的納米抗體無抗病毒活性。
- 針對 GPCR 類靶點（如 EGFR），二次免疫羊駝的抗體多結合胞外區(qū)非活性構象表位，無法阻斷受體信號通路，而零免疫羊駝的抗體更易識別活性構象關鍵位點。
既往免疫產(chǎn)生的預存抗體可能與新抗原存在結構相似性，導致非特異性結合，增加篩選假陽性。例如：
- 曾免疫過 HER2 抗原的羊駝，再免疫 EGFR 時，部分抗 HER2 VHH 會因 HER2 與 EGFR 的同源結構（約 40% 氨基酸相似），與 EGFR 非特異性結合，ELISA 檢測假陽性率從 5% 升至 35%，需額外通過競爭結合實驗、表位 mapping 驗證，延長研發(fā)周期 2-3 周。
核心隱患在于 “信息不對稱”—— 部分客戶為保護靶點隱私，會隱瞞羊駝既往免疫的抗原類型、標簽（如 His、Fc），導致新抗原與既往抗原可能存在交叉（如同一蛋白家族、相似標簽），引發(fā)免疫失敗：
- 若新抗原為 “His 標簽 - 蛋白 A”，而羊駝曾免疫 “His 標簽 - 蛋白 B”，則免疫系統(tǒng)會優(yōu)先產(chǎn)生抗 His 標簽的抗體，而非抗蛋白 A 的特異性 VHH，最終抗體庫中 90% 以上為抗標簽抗體，無法獲得目標分子。
免疫干擾會直接導致免疫文庫被既往抗原的 VHH 污染，目標抗體比例驟降，篩選效率大幅降低，甚至遺漏高親和力候選分子。
二次免疫羊駝構建的噬菌體展示文庫中，針對新抗原的 VHH 占比通常低于 30%，其余為針對既往抗原的非目標 VHH。例如：
- 某團隊用曾免疫過 TNF-α 的羊駝免疫 IL-6，構建的文庫中僅 25% VHH 能與 IL-6 結合，其余 75% 均為抗 TNF-α VHH；而零免疫羊駝的 IL-6 文庫中，目標 VHH 占比可達 60%-70%。
為排除非目標 VHH，需增加 “預清除” 步驟（用既往抗原吸附文庫），或進行多輪篩選（從 3 輪增至 5-6 輪），工作量增加 2-3 倍；同時，低豐度但高親和力的目標 VHH 可能在預清除中被誤吸附，導致優(yōu)質候選分子流失。某研究顯示，二次免疫文庫經(jīng)預清除后，高親和力 VHH（KD<1nM）的回收率僅為零免疫文庫的 40%。
羊駝經(jīng)多次免疫后，B 細胞經(jīng)歷反復克隆選擇，VHH 基因庫的多樣性會顯著降低，尤其是框架區(qū)（FR）與互補決定區(qū)（CDR）的結構多樣性，直接削弱納米抗體的核心優(yōu)勢。
既往免疫會導致 VHH 的 FR 區(qū)（維持抗體結構穩(wěn)定的關鍵區(qū)域）基因趨同，不同 VHH 的 FR 序列相似度從 40%-60% 升至 70%-80%，限制抗體的空間構象多樣性。例如：
- 二次免疫羊駝的 VHH 中，F(xiàn)R2 區(qū)的 “E44-R45-G47” 保守序列占比超 90%，而零免疫羊駝中該序列占比僅 50%，其余為 “E44-K45-A47”“Q44-R45-G47” 等變異類型，更易形成適配復雜表位的構象。
CDR3 是 VHH 結合抗原的核心區(qū)域，其長度（通常 10-20 個氨基酸）直接決定表位覆蓋范圍。二次免疫會導致 CDR3 平均縮短 2-3 個氨基酸，且序列保守性增加：
- 零免疫羊駝的 VHH CDR3 平均長度為 15-16 個氨基酸，可形成 “凸環(huán)” 結構深入抗原隱蔽表位（如酶活性中心）；而二次免疫羊駝的 CDR3 平均長度僅 12-13 個氨基酸，難以結合復雜表位，導致抗體親和力下降 1-2 個數(shù)量級（從 nM 級降至 μM 級）。
二次免疫羊駝的 VHH 攜帶更多 “駝源特征”，且可能積累隨機突變，增加人源化改造難度；同時，既往免疫可能使抗體親和力接近 “平臺期”，后續(xù)優(yōu)化空間受限。
既往抗原刺激會導致 VHH 表面暴露出更多羊駝特異性表位（如 FR2 區(qū)的駝源氨基酸），人源化時需通過定點突變、CDR 移植消除：
- 零免疫羊駝的 VHH 人源化通常需 3-5 個突變位點，改造周期 4-6 周；而二次免疫羊駝的 VHH 需 8-10 個突變位點，改造周期延長至 8-10 周，且突變可能破壞抗體結構，導致穩(wěn)定性下降（Tm 值降低 5-8℃）。
部分既往免疫的 VHH 為適配特定抗原，會保留 N - 糖基化位點（Asn-X-Ser/Thr），而原核表達系統(tǒng)（如大腸桿菌）無法實現(xiàn)糖基化，需更換為真核系統(tǒng)（如 CHO 細胞）：
- 真核表達的成本是原核的 2-3 倍，且表達量降低（從 200-300mg/L 降至 50-100mg/L），大幅推高生產(chǎn)費用。
二次免疫的 VHH 可能積累非功能性突變（如 FR3 區(qū)的 Pro→Leu），導致親和力已接近平臺期（KD≈10??M），進一步優(yōu)化需引入高風險突變（如 CDR 插入氨基酸），但可能導致抗體解折疊，成功率僅 30% 左右，遠低于零免疫 VHH 的 60%-70%。
二次免疫 VHH 的結構特性（如糖基化、構象剛性）會限制其工程化改造，且免疫原性風險不可控，影響臨床轉化。
既往免疫使 VHH 的構象趨于固定，難以與其他功能分子（如細胞毒素、細胞因子）融合：
- 零免疫羊駝的抗 PD-1 VHH 與 IL-2 融合后，仍能保持 80% 以上的 PD-1 結合活性；而二次免疫羊駝的抗 PD-1 VHH 融合 IL-2 后，活性僅保留 40%-50%，因構象剛性導致融合后表位結合位點被遮蔽。
在雙特異性抗體設計中，二次免疫 VHH 的表位結合模式可能與新靶點產(chǎn)生空間位阻：
- 某團隊用二次免疫羊駝的抗 CD3 VHH 與抗 HER2 VHH 構建雙抗，因抗 CD3 VHH 的結合表位靠近 CD3 的跨膜區(qū)，與抗 HER2 VHH 的空間構象沖突，導致雙抗無法同時結合兩個靶點，而零免疫 VHH 構建的雙抗成功率達 80%。
二次免疫 VHH 的 N - 糖基化位點出現(xiàn)頻率是零免疫組的 3 倍，這些糖基化修飾可能被人體免疫系統(tǒng)識別為 “外源糖鏈”，引發(fā)抗藥抗體（ADA）反應：
- 臨床前數(shù)據(jù)顯示，二次免疫 VHH 的 ADA 發(fā)生率約 15%-20%，而零免疫 VHH 經(jīng)人源化后，ADA 發(fā)生率可降至 5% 以下，顯著提升臨床安全性。
二次免疫看似降低了短期飼養(yǎng)成本，實則因風險導致長期成本激增，且可能引發(fā)專利糾紛。
全球已公開的羊駝抗體專利中，41% 涉及特定抗原的免疫方案，若使用已免疫羊駝開發(fā)的 VHH 與現(xiàn)有專利序列同源性≥85%，可能落入專利保護范圍。例如：
- 某企業(yè)用二次免疫羊駝開發(fā)的抗 EGFR VHH，因與已授權專利的 VHH FR 區(qū)同源性達 90%，被起訴侵權，項目停滯 6 個月，賠償金額超千萬元。
二次免疫的隱性成本遠超短期節(jié)約：
- 時間成本：篩選周期從 4 周延長至 8 周，驗證實驗（如交叉反應、表位 mapping）增加 3-4 項；
- 失敗成本：約 20% 的二次免疫項目因抗體質量不達標需重新免疫，重復投入的成本是零免疫的 1.5 倍；
- 生產(chǎn)風險：工程化改造后的抗體批次穩(wěn)定性下降，失敗率從 5% 升至 15%，進一步推高成本。
羊駝二次免疫看似是 “成本優(yōu)化”，實則是引入多重風險的 “短視選擇”—— 從免疫應答偏差到文庫污染，從抗體多樣性喪失到知識產(chǎn)權糾紛，每一項風險都可能導致研發(fā)周期延長、成本激增，甚至項目失敗。在納米抗體向臨床轉化的關鍵階段，選擇 “零免疫背景” 羊駝，從源頭保障抗體的特異性、多樣性與安全性，才是兼顧研發(fā)效率與臨床價值的最優(yōu)解。
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