易基因：Nat Commun/IF15.7：多組學研究揭示UHRF2在原始生殖細胞DNA甲基化重編程中的抗性調控機制

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近日，法國斯特拉斯堡大學Michael Weber團隊通過多種實驗方法揭示了原始生殖細胞（Primordial Germ Cells, PGCs）中DNA甲基化重編程的抗性機制，重點闡明了UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中的關鍵作用，并探討了其對生殖細胞發育和功能的作用。研究結果表明，UHRF2在維持逆轉錄轉座子甲基化、調節減數分裂基因表達和卵母細胞發育中發揮著重要作用。UHRF2缺失在雌性生殖細胞中導致減數分裂基因過表達和卵母細胞發育受損。相關研究成果以“UHRF2 mediates resistance to DNA methylation reprogramming in primordial germ cells“為題發表于《Nature Communications》期刊。

標題：UHRF2 mediates resistance to DNA methylation reprogramming in primordial germ cells（UHRF2介導原始生殖細胞對DNA甲基化重編程的抗性）

發表時間：2025年8月9日

發表期刊：Nature Communications

影響因子：IF15.7/Q1

技術平臺：微量單細胞RRBS、RNA-seq、Target-BS等（易基因金牌技術）

DOI:10.1038/s41467-025-61954-0

哺乳動物的原始生殖細胞（PGCs）會經歷全局性DNA去甲基化，但對生殖有關基因表現出延遲的去甲基化現象，并在進化上年輕的逆轉錄轉座子區域選擇性保留DNA甲基化。然而PGCs中DNA甲基化維持的分子機制尚不清楚。本研究首先揭示了DNMT1輔因子UHRF1的同源基因UHRF2是PGCs對DNA甲基化重編程抗性的關鍵調控因子。Uhrf2基因敲除小鼠的PGCs中表現出逆轉錄轉座子DNA甲基化缺失，而體細胞中的DNA甲基化則不受影響。這與E13.5 PGCs中逆轉錄轉座子表達變化無關，表明在這一階段存在其他機制補償逆轉錄轉座子的調控。此外，Uhrf2缺失的PGCs表現出生殖有關基因的提前去甲基化，且在雌性中過表達減數分裂基因。隨后，Uhrf2缺失的小鼠表現出卵母細胞發育受損、雌性特有的生育力降低以及在精子發生中逆轉錄轉座子不完全再甲基化。這些發現揭示了UHRF1同源基因UHRF2在調控生殖譜系DNA甲基化中的關鍵功能。

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研究方法

本研究通過多種實驗方法，包括小鼠模型構建、微量單細胞DNA甲基化測序、流式細胞分選、RNA測序（RNA-seq）、免疫熒光實驗、組織學分析和生殖能力測試，全面揭示了UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中的關鍵作用。這些方法的綜合應用為理解PGCs中的表觀遺傳調控機制提供了重要的實驗依據。

小鼠模型構建：UHRF2基因敲除（knock-out, KO）小鼠模型和Dnmt1條件性敲除（conditional knock-out, cKO）小鼠模型。
微量單細胞甲基化測序（RRBS）：使用Oct4-GFP轉基因小鼠模型，通過流式細胞分選（FACS）技術分離純化的PGCs。分析E9.5到E17.5不同發育階段的PGCs進行高深度測序，分析DNA甲基化動態變化。
RNA測序（RNA-seq）：從E8.5胚胎和E13.5 PGCs中提取總RNA，分析基因表達變化，特別是與DNA甲基化相關的基因表達。
免疫熒光實驗：通過免疫熒光技術檢測UHRF2蛋白在PGCs中的表達和定位。
組織學分析（Histology）：對卵巢和睪丸進行組織學分析，觀察UHRF2缺失對生殖細胞發育的作用。
生育能力測試：將UHRF2突變小鼠與野生型小鼠交配，觀察后代數量，評估生育能力。
其他實驗：LUMA檢測整體CpG甲基化水平。Bisulfite測序分析特定基因啟動子區域的甲基化狀態。Western Blot檢測UHRF2和UHRF1蛋白表達。

結果圖形

（1）PGC發育過程中的DNA甲基化動態變化

研究通過RRBS技術，對小鼠PGCs從胚胎階段E8.5到E17.5的DNA甲基化進行了全面分析。分析結果表明，與上胚層相比，PGCs在E9.5時低甲基化，且在E10.5到E13.5期間發生全局性去甲基化。雄性PGCs從E14.5開始恢復全局甲基化，而雌性PGCs則保持低甲基化狀態。此外研究還發現，某些基因啟動子區域的去甲基化速率比全基因組慢，表明這些區域甲基化具有延遲性。這些結果為理解PGCs中DNA甲基化的動態變化提供了重要數據。

圖 1：DNMT1介導PGCs中的選擇性維持DNA甲基化

RRBS檢測E7.5上胚層（Epb）及PGC發育過程中的整體 CG 甲基化水平。樣本平均覆蓋的CpG位點數為CGI 的n=599,050 和non-CGI的n=560,437。
三個生殖有關基因（Dazl、Tuba3b、Taf7l）的CG富集啟動子區域的RRBS甲基化圖譜，以及Etv6 對照基因外顯子序列的甲基化圖譜。
與全基因組相比，PGCs 中生殖有關基因啟動子區域去甲基化動態變化。全基因組包括上胚層中甲基化>50% 及E13.5 PGCs中甲基化< 20%的所有CG中位數甲基化水平。
與全基因組相比，雌性和雄性E13.5 PGCs 中殘留甲基化區域（RMRs）內各CpG 位點甲基化水平（全基因組n=18,909,193個CpG位點，RMRs n=350,807個CpG位點）。
雌性和雄性E13.5 PGCs 中 RMRs 的重疊維恩圖。
RMRs 中不同轉座元件（TE）家族的分布情況餅圖。
與全基因組相比，E13.5 PGCs 中最高甲基化逆轉錄轉座子家族的甲基化情況。箱線圖顯示在 WGBS或RRBS數據集中與每個逆轉錄轉座子家族各拷貝重疊的各個 CpG 位點甲基化水平分布。平均而言，WGBS和RRBS數據集分別覆蓋69%和12%的基因組拷貝數。
E13.5 PGCs 中持續甲基化的逆轉錄轉座子WGBS 甲基化圖譜示例。
通過RRBS對PGC發育過程中最高甲基化的逆轉錄轉座子家族CG甲基化水平進行定量分析。
與同窩對照（WT）相比，Dnmt1條件性敲除（cKO）E13.5 PGCs RMRs 內各個 CpG 位點的甲基化水平的箱線圖（WT n=35024個CpG位點，WT n=33610個CpG 位點，雜合子Het n=32389個CpG位點，Het n=31170個CpG位點，Het n=26439個CpG位點，Het n=23172個CpG位點，cKO n=27940個CpG位點，cKO n=24732個CpG位點）。
Dnmt1 條件性敲除和對照 E13.5 PGCs 中的逆轉錄轉座子的 RRBS 甲基化圖譜示例。

（2）PGC中逆轉錄轉座子對DNA去甲基化的位點特異性抗性

通過分析E13.5 PGCs的全基因組數據，研究發現了20,255個和19,262個殘留甲基化區域（Residually Methylated Regions, RMRs），這些區域在逆轉錄轉座子中富集，尤其是年輕的LTR和非LTR逆轉錄轉座子（如ERVK、ERV1和L1Md家族）。這些逆轉錄轉座子在PGCs中表現出對去甲基化的抗性，其甲基化水平在PGCs發育過程中保持穩定。通過條件性敲除Dnmt1基因，進一步證實了DNMT1在維持這些逆轉錄轉座子甲基化中的關鍵作用。

（3）UHRF2在PGCs中維持DNA甲基化不可或缺

研究發現，UHRF2在PGCs中高表達，且其蛋白主要定位于細胞核。通過UHRF2基因敲除小鼠模型，發現UHRF2缺失導致PGCs中逆轉錄轉座子甲基化丟失，而體細胞中的DNA甲基化則不受影響。這表明UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中發揮著不可或缺的作用。

圖2：Uhrf2在PGCs中的表達及Uhrf2基因敲除小鼠特征

小鼠UHRF1和UHRF2蛋白質結構。
通過RNA-seq檢測Uhrf2、Uhrf1和Dnmt1基因在胚胎干細胞（ESCs）、E8.5胚胎以及雄性（m）和雌性（f）E13.5 PGCs中的表達。
在表達Oct4-GFP的E13.5雌性或雄性性腺細胞中，對UHRF2進行免疫熒光分析。
本研究中使用的Uhrf2基因敲除等位基因示意圖。
PND10 Uhrf2缺失小鼠和WT小鼠的脾臟和大腦中UHRF2和UHRF1蛋白Western blot分析。
通過Uhrf2-/+×Uhrf2-/+（左）或Uhrf2L1/+×Uhrf2L1/+（右）雜交得到的8日齡幼崽的基因型分布。
Uhrf2與同窩野生型小鼠的產后存活曲線對比。
與同窩小鼠相比，PND10時Uhrf2-/-小鼠出現生長遲緩的情況。
與雜合子和野生型同窩小鼠相比，由Uhrf2雜合子父母交配得到的Uhrf2缺失小鼠（上）以及由 Uhrf2L1/+父母交配得到的 Uhrf2L1/L1 小鼠（下）體重對比。出生后第 8、15 和 21 天測量體重。

圖3：Uhrf2對PGCs中的DNA甲基化至關重要，但對體細胞則不受影響

LUMA檢測的Uhrf2-/-小鼠與WT PND21小鼠大腦和肝臟中的整體CG甲基化水平。
通過RRBS對Uhrf2-/-小鼠與WT PND21小鼠的大腦、肝臟和心臟中的CG甲基化進行定量分析。分別顯示了CpG島外（non-CGI）和CpG島內（CGI）的CG甲基化水平。
通過流式細胞術從Uhrf2突變小鼠與同窩WT E13.5胚胎的性腺中回收的PGCs數量（WT n=16個胚胎，Uhrf2-/- n=16，WT n=10，Uhrf2L1/L1n=9）。
將來自Uhrf2-/-和Uhrf2L1/L1小鼠的E13.5 PGCs與它們同窩WT胚胎進行比較RRBS CG甲基化評分在500bp窗口中的相關性。
與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-和Uhrf2L1/L1小鼠中雄性和雌性PGCs內RMRs中各個CpG位點的甲基化水平箱線圖。
與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-和Uhrf2L1/L1小鼠中雄性和雌性PGCs中ERV家族的平均甲基化水平。
Uhrf2突變和WT E13.5 PGCs中逆轉錄轉座子的RRBS甲基化圖譜示例。

（4）Uhrf2介導的DNA甲基化對于原始生殖細胞（PGCs）中逆轉錄轉座子的抑制并非必需

盡管UHRF2缺失導致逆轉錄轉座子的甲基化丟失，但RNA-seq分析結果揭示，其逆轉錄轉座子表達并未顯著增加。這表明在PGCs中，DNA甲基化可能不是抑制逆轉錄轉座子的主要機制，其他表觀遺傳機制（如H3K9me3和H3K27me3）可能在維持逆轉錄轉座子沉默中發揮補償作用。

圖4：Uhrf2失活導致E13.5 PGCs中減數分裂基因表達增加，但逆轉錄轉座子表達未增加。

火山圖顯示在雄性和雌性Uhrf2-/- E13.5 PGCs中轉座元件（TE）家族的差異表達。
與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-中Dnmt和Uhrf1基因的FPKM表達值。
在雄性和雌性Uhrf2-/- E13.5 PGCs中鑒定出的顯著上調和下調基因數量。
與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-中多能性和生殖系身份調控因子的表達。圖例與b相同。
在雌性Uhrf2-/- E13.5 PGCs中上調基因中顯著富集的GO分析。
與WT E13.5 PGCs相比，雌性Uhrf2-/-的差異基因表達火山圖。
Uhrf2-/-和Dnmt1-cKO E13.5 PGCs中上調基因重疊的維恩圖。
Uhrf2L1/L1與WT E11.5 PGCs相比，Tuba3b啟動子的目標區域亞硫酸鹽測序分析。
通過免疫染色檢測STRA8（紅色核信號）來鑒定對照（WT）和突變E13.5胎兒卵巢切片中的減數分裂細胞。

（5）Uhrf2失活導致雌性PGCs中減數分裂基因過表達

RNA-seq分析顯示，UHRF2缺失的雌性PGCs中，許多減數分裂相關基因（如Stra8、Sycp1等）表達顯著上調。這些基因的過表達可能導致雌性PGCs提前進入減數分裂，進而影響卵子發育。免疫熒光實驗進一步證實UHRF2缺失的雌性PGCs中出現了更多的減數分裂標志物陽性細胞。

（6）Uhrf2對卵母細胞發育的必要性

組織學分析顯示，UHRF2缺失的雌性小鼠卵巢中原始卵泡數量減少，且在生育能力測試中，UHRF2缺失的雌性小鼠生育能力顯著下降。這些結果表明，UHRF2在卵母細胞發育中發揮著關鍵作用。

圖5：Uhrf2失活會損害卵母細胞發育和精子發生過程中的逆轉錄轉座子甲基化

H&E染色的PND80時野生型（WT）和Uhrf2-/-雌性小鼠卵巢的組織切片。
在PND80的卵巢切片中，Uhrf2突變和WT同窩小鼠雌性的初級、次級和竇狀卵泡的數量。
在PND15的卵巢連續切片中，Uhrf2L1/L1和WT同窩小鼠雌性的原始卵泡數量（左側）以及初級、次級和竇狀卵泡數量（右側）。
與WT同窩對照組相比，Uhrf2缺失雌性小鼠所生的幼崽數量。
用H&E染色的PND80時野生型（WT）和Uhrf2-/-雄性小鼠睪丸的代表性組織切片。
PND80時Uhrf2缺失雄性小鼠與其同窩對照組的睪丸與體重比。Uhrf2L1/L1雄性小鼠與WT和Uhrf2L1/+雜合子進行了比較。
與同窩對照組相比，Uhrf2缺失雄性小鼠交配所生的幼崽數量。
在Uhrf2-/-與WT精子中，500bp范圍內RRBS CG甲基化評分的相關性。
在Uhrf2缺失精子中鑒定出的與轉座元件（TEs）共定位的差異甲基化區域（DMRs）比例。
與WT精子相比，Uhrf2缺失精子中選定的ERV和L1家族的平均甲基化水平。
在Uhrf2缺失PGCs和精子中低甲基化的逆轉錄轉座子序列的兩個示例。

（7）Uhrf2 失活會損害精子發生過程中的逆轉錄轉座子再甲基化

在雄性生殖細胞中，UHRF2缺失導致精子中逆轉錄轉座子低甲基化。盡管如此，UHRF2缺失的雄性小鼠仍能產生功能正常的精子并保持生育能力。這表明UHRF2在精子發生過程中對逆轉錄轉座子的再甲基化具有重要作用，但并非絕對必要。

討論和啟示

本研究揭示了UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中的關鍵作用。UHRF2可能通過與DNMT1協同，維持逆轉錄轉座子的甲基化，防止潛在有害元件的激活。此外，UHRF2在調節減數分裂基因表達和卵子發育中也發揮重要作用。盡管UHRF2缺失對雄性生殖細胞的作用不明顯，但在雌性生殖細胞中，UHRF2缺失導致減數分裂基因過表達和卵子發育損害。這些發現為理解PGCs中的表觀遺傳調控機制提供了新的見解，并為未來的研究提供了新的方向。

微量單細胞甲基化測序分析的作用

微量單細胞甲基化測序技術在本研究中發揮了重要作用。通過微量RRBS技術，研究者能夠高分辨率地分析PGCs在不同發育階段的DNA甲基化動態變化，揭示全基因組去甲基化和特定區域的甲基化抗性。這種技術不僅提供了詳細的甲基化圖譜，還幫助研究者發現了UHRF2在維持特定DNA甲基化模式中的關鍵作用。未來，微量單細胞甲基化測序技術有望在更多類似研究中應用，特別是在探索表觀遺傳調控機制和細胞命運決定中的研究和應用。

目前，易基因科技有限公司在DNA甲基化修飾等表觀遺傳檢測領域，積累了一系列國際先進技術，可對高通量單細胞甲基化組學研究，微量DNA甲基化測序，ctDNA、FFPE等嚴重降解痕量DNA甲基化檢測等，提供多種有效解決方案。低成本、高通量的單細胞甲基化組學測序技術建立，將為研究者對不同時間和空間的單細胞表觀修飾研究奠定基礎。

微量細胞或單細胞全基因組甲基化測序(Micro DNA-WGBS)DNA起始量：
單細胞/100-1000個細胞
1ng基因組DNA
90%以上基因組CG覆蓋
微量細胞或DNA簡化基因組甲基化測序(Micro DNA-RRBS)DNA起始量：
1ng基因組DNA；
10-20M有效CG位點覆蓋；
10-20G測序數據量；
微量cfDNA簡化基因組甲基化測序(cfDNA-RBS)

100ul血漿或1ng cfDNA

10M有效CG位點覆蓋

15-20G測序數據量

參考文獻：

Bender A, Morel M, Dumas M, Klopfenstein M, Osmani N, Greenberg MVC, Bourc'his D, Ghyselinck NB, Weber M. UHRF2 mediates resistance to DNA methylation reprogramming in primordial germ cells. Nat Commun. 2025 Aug 9;16(1):7350. doi: 10.1038/s41467-025-61954-0.

易基因：Nat Commun/IF15.7：多組學研究揭示UHRF2在原始生殖細胞DNA甲基化重編程中的抗性調控機制

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