易基因：基于三代ONT長讀長測序和二代短讀長測序的DNA甲基化檢測方法系統(tǒng)比較｜Genome Biol/IF10

大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。

長讀長測序最常用方法主要包括Oxford Nanopore Technologies（ONT）的納米孔測序和PacBio的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測序。近日，冰島deCODE Genetics公司/雷克雅未克大學(xué)Brynja D. Sigurpalsdottir等人系統(tǒng)比較了長讀長測序技術(shù)（ONT和SMRT測序）在檢測人基因組DNA甲基化（特別是CpG甲基化）方面的性能。研究共使用7,179個(gè)ONT測序樣本、132個(gè)精準(zhǔn)甲基化測序（oxBS）樣本和50個(gè)SMRT測序樣本，詳細(xì)評估不同測序技術(shù)和分析工具在檢測CpG甲基化（5-mCpG）時(shí)的準(zhǔn)確性、一致性及局限性。研究還引入了質(zhì)量過濾器以提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性，并強(qiáng)調(diào)了最新一代ONT R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測中的優(yōu)勢。相關(guān)研究成果以《A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes》為題發(fā)表于《Genome Biology》期刊。

標(biāo)題：A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes（人基因組DNA甲基化長讀長測序檢測方法比較）

發(fā)表時(shí)間：2024-03-11

發(fā)表期刊：Genome Biology

影響因子：IF10.1/Q1

技術(shù)平臺(tái)：ONT、oxBS、SMRT

DOI：10.1186/s13059-024-03207-9

本研究揭示了7,179個(gè)納米孔測序的DNA樣本中檢測到的CpG甲基化具有高度準(zhǔn)確性和一致性，與相同血液樣本中分離出來的132個(gè)精準(zhǔn)甲基化測序（oxBS）樣本的檢測結(jié)果相匹配。研究引入靶向CpG位點(diǎn)的質(zhì)量過濾器(過濾約30%的CpG)以進(jìn)一步提高納米孔測序CpG甲基化檢測的準(zhǔn)確性。研究評估了在不同基因組特征和CpG甲基化率下，每個(gè)位點(diǎn)的CpG甲基化檢測性能，并展示了最新的ONT R10.4芯片和堿基識(shí)別算法優(yōu)化ONT納米孔測序中的甲基化檢測的具體過程。此外，研究還納入了50個(gè)SMRT測序樣本基因組的甲基化檢測結(jié)果和oxBS測序的結(jié)果，與ONT測序進(jìn)行橫向比較研究闡明了每種測序方法的優(yōu)勢和局限性，并為使用長讀長測序進(jìn)行基因組規(guī)模的堿基修飾檢測工具的標(biāo)準(zhǔn)化和評估提出了建議。

易小結(jié)

本研究系統(tǒng)比較了長讀長測序技術(shù)在檢測CpG甲基化中的性能，特別強(qiáng)調(diào)了ONT R10芯片的顯著優(yōu)勢，包括更優(yōu)秀的甲基化檢測準(zhǔn)確性和優(yōu)化的堿基識(shí)別能力，為表觀遺傳學(xué)研究提供了更高效、更精準(zhǔn)的工具。

ONT R10長讀長測序技術(shù)因其在CpG甲基化檢測中的高準(zhǔn)確性和直接檢測能力，已成為表觀基因組學(xué)研究中的重要工具。易基因作為專注于表觀基因組學(xué)研究的領(lǐng)先企業(yè)，通過引入最新的ONT R10芯片技術(shù)，易基因能夠?yàn)榭蛻籼峁└叻直媛省⒏鼫?zhǔn)確的甲基化檢測服務(wù)，助力疾病機(jī)制研究、生物標(biāo)志物開發(fā)以及個(gè)性化醫(yī)療等領(lǐng)域的前沿探索。

研究方法

ONT測序：使用PromethION R9.4和R10.4芯片，通過檢測DNA分子通過納米孔時(shí)的電流變化來識(shí)別甲基化修飾。

SMRT測序：通過檢測DNA合成過程中堿基摻入的動(dòng)力學(xué)變化來識(shí)別甲基化修飾。

oxBS測序：通過化學(xué)氧化和亞硫酸鹽處理精準(zhǔn)區(qū)分5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。

數(shù)據(jù)分析工具：

• Nanopolish：使用隱馬爾可夫模型（HMM）為每個(gè)CpG位點(diǎn)分配甲基化狀態(tài)。
• Guppy：基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）工具，可在堿基識(shí)別階段直接檢測CpG甲基化。
• Primrose：SMRT測序數(shù)據(jù)的甲基化檢測，通過結(jié)合鄰近CpG位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)信息來提高檢測準(zhǔn)確性。

質(zhì)量過濾器：引入多種質(zhì)量過濾器，包括過濾序列變異周圍CpG位點(diǎn)、低質(zhì)量區(qū)域（如暗區(qū)）CpG位點(diǎn)以及異常測序深度或高鏈偏倚的CpG位點(diǎn)。

結(jié)果圖形

（1）ONT納米孔測序檢測CpG甲基化

研究首先利用promethION平臺(tái)對7,179名個(gè)體全血樣本進(jìn)行Nanopore測序，平均測序度為20.6×（中位數(shù)為19.5×，范圍從10×到108×）。同一樣本還被用于研究CpG甲基化、基因表達(dá)和序列變異之間的相關(guān)性。研究通過Nanopolish工具進(jìn)行CpG甲基化檢測，該工具將相距10bp以內(nèi)的CpG位點(diǎn)歸為一個(gè)單元，稱為CpG單元。Nanopolish以參考基因組比對的reads為input和每個(gè)read數(shù)據(jù)參考基因組的鏈信息，為每個(gè)CpG單元判斷其對數(shù)似然比（LLR）。LLR為二進(jìn)制值，表示測序CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。當(dāng)LLR未達(dá)到預(yù)測CpG單元為甲基化或未甲基化標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將CpG單元分類為“不可靠”。本研究分析范圍為隊(duì)列中Nanopolish檢測到的22,178,458個(gè)常染色體CpG單元，共27,651,488個(gè)CpG位點(diǎn)。

（2）ONT測序和oxBS的CpG甲基化檢測比較

研究對132個(gè)個(gè)體的DNA樣本進(jìn)行Nanopore測序和oxBS測序比較分析以評估Nanopore測序在CpG甲基化檢測中的準(zhǔn)確性。樣本平均測序深度為25×，每個(gè)CpG單元在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中分別計(jì)算了所有個(gè)體的平均5-mCpG率，并通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）來評估Nanopolish工具性能。結(jié)果顯示，兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的APC非常高（r=0.9594），表明Nanopore測序的甲基化檢測結(jié)果與oxBS測序結(jié)果高度一致。

圖1：ONT測序和oxBS在同一DNA樣本中5-甲基胞嘧啶（5-mCpG）率的一致性表現(xiàn)。

A. 132個(gè)DNA樣本中ONT（紅色）和oxBS（綠色）的5-mCpG率整體檢測值。

B-C. ONT測序中每個(gè)CpG位點(diǎn)的5-mCpG率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)r（B）和平均絕對差異（MAD）（C）。

D. ONT測序樣本中用于分析特定CpG位點(diǎn)的5-mCpG率的序列數(shù)量（X軸），影響與oxBS高深度檢測5-mCpG率的一致性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r，Y軸）。

E. ONT測序（Y軸）和oxBS（X軸，分組）中的CpG率。平均值紅色（ONT）和綠色（oxBS）。

F. 樣本間比較通過ONT測序正確分類的CpG位點(diǎn)數(shù)量（Y軸，單位=/M CpGs，藍(lán)色）。錯(cuò)誤分類的CpG位點(diǎn)根據(jù)5-mCpG率的MAD著色（顏色圖例）。D/E/F中的oxBS位點(diǎn)測序深度>25×。

（3）測序深度影響ONT測序數(shù)據(jù)中CpG甲基化檢測的一致性

研究進(jìn)一步探討了測序深度對Nanopore測序CpG甲基化檢測一致性的影響。結(jié)果顯示，測序深度越高，CpG甲基化檢測一致性越好。當(dāng)測序深度在12×或更高時(shí)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯著提高，而20×或更高的測序深度時(shí)，檢測結(jié)果一致性進(jìn)一步提高。當(dāng)測序深度低于10×?xí)r，甲基化檢測準(zhǔn)確性會(huì)顯著下降。這一結(jié)果表明，較高的測序深度能夠顯著提高CpG甲基化檢測的準(zhǔn)確性和一致性。為了獲得高準(zhǔn)確性的CpG甲基化檢測結(jié)果，建議每個(gè)樣本的測序深度至少為12×，20×或更高則更為理想。

（4）ONT測序數(shù)據(jù)在未甲基化和高甲基化CpG單元中的一致性更高

研究發(fā)現(xiàn)，ONT測序在未甲基化和高甲基化CpG單元的檢測上表現(xiàn)更為一致。研究將CpG位點(diǎn)分為未甲基化（0–0.15）、低甲基化（0.15–0.5）、中等甲基化（0.5–0.85）和高甲基化（0.85–1）四個(gè)類別，通過比較ONT測序和oxBS的結(jié)果顯示，Nanopore測序在未甲基化和高甲基化CpG單元上的預(yù)測準(zhǔn)確性最高，分別為86%和77%。這表明Nanopore測序在極端甲基化狀態(tài)下檢測更為可靠，而在低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的檢測準(zhǔn)確性相對較低，分別為52%和56%。這一結(jié)果為研究者在選擇測序技術(shù)和分析工具時(shí)提供重要的參考依據(jù)。

（5）Nanopolish甲基化檢測質(zhì)量受CpG單元序列背景影響

研究發(fā)現(xiàn)，Nanopolish甲基化檢測質(zhì)量受CpG單元序列背景的影響。為了分析這種影響，研究者將CpG單元分為序列變異周圍（5bp以內(nèi)）、“暗區(qū)”（即難以可靠比對的區(qū)域）、具有異常測序深度（高于平均深度1.5倍或低于平均深度0.5倍）以及存在鏈偏倚（大于0.2）的4個(gè)CpG單元。分析結(jié)果表明，序列變異周圍CpG位點(diǎn)（5bp以內(nèi)）的預(yù)測準(zhǔn)確性較低，其APC為0.9219，而其他CpG位點(diǎn)的APC為0.9656。此外，“暗區(qū)”CpG位點(diǎn)APC也較低，為0.698。這些結(jié)果表明，序列背景對Nanopore測序的甲基化檢測準(zhǔn)確性有顯著影響。因此，在進(jìn)行CpG甲基化檢測時(shí)，需要特別關(guān)注這些區(qū)域的質(zhì)控，以提高檢測結(jié)果的可靠性。

圖2：根據(jù)DNA序列屬性評估5-mCpG率檢測質(zhì)量。

A. 比較位于特定序列屬性內(nèi)部（灰色）和外部（粉色）的CpG位點(diǎn)的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）。

B. 每個(gè)屬性內(nèi)部的CpG單元（紅色）和位點(diǎn)（綠色）數(shù)量。

C. 單個(gè)CpG單元（單例）和多CpG位點(diǎn)單元（非單例）中高質(zhì)量（深藍(lán)色）與非高質(zhì)量（淺藍(lán)色）CpG單元的比例。

D. 不同甲基化狀態(tài)類別中高質(zhì)量和非高質(zhì)量CpG單元比例。

（6）與oxBS數(shù)據(jù)的對比分析中，Guppy在CpG位點(diǎn)甲基化檢測上表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish

研究比較了Guppy和Nanopolish在CpG位點(diǎn)的甲基化檢測。分析結(jié)果表明Guppy在與oxBS測序結(jié)果的對比分析中表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish。具體而言，Guppy與oxBS測序結(jié)果的APC為0.97256，高于Nanopolish的0.9594。且Guppy平均鏈偏倚更低，表明其甲基化檢測準(zhǔn)確性更高。通過應(yīng)用與Nanopolish相同的質(zhì)量過濾器，Guppy能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)（hq-CpGs），其APC為0.98691。這一結(jié)果表明，Guppy在CpG甲基化檢測上具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性，特別是在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點(diǎn)時(shí)表現(xiàn)更為出色。

（7）最新的Nanopore R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測上實(shí)現(xiàn)了更高準(zhǔn)確性和改進(jìn)的檢測結(jié)果

研究人員對ONT的最新R10.4芯片在CpG甲基化檢測方面的表現(xiàn)進(jìn)行了評估，并與早期的R9.4芯片進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，R10.4芯片在多個(gè)方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，特別是在提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性和減少鏈偏倚方面。

• 更高的APC：在所有CpG位點(diǎn)中，R10.4芯片預(yù)測的5-mCpG率與oxBS數(shù)據(jù)的APC為0.97845，高于R9.4芯片的0.97256。表明R10.4芯片在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性更高。
• 更低的MAD：Guppy R10.4在與oxBS的甲基化檢測比較中顯示出比Guppy R9.4更低的MAD，進(jìn)一步證明了其在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性。
• 更低的鏈偏倚：R10.4芯片的平均鏈偏倚為0.047，顯著低于R9.4芯片的0.064。鏈偏倚是指正鏈和負(fù)鏈上預(yù)測的甲基化率差異，較低的鏈偏倚表明R10.4芯片在甲基化檢測上的可靠性更高。
• 更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)：應(yīng)用相同的質(zhì)量過濾器，R10.4芯片能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點(diǎn)（hq-CpGs），數(shù)量達(dá)到22893522個(gè)（82.8%），與R9.4芯片相比增加了2.3%。表明R10.4芯片在提高甲基化檢測位點(diǎn)覆蓋率方面具有顯著優(yōu)勢。
• 高質(zhì)量CpG位點(diǎn)更高的APC：這些高質(zhì)量CpG位點(diǎn)的APC為0.99067，表明R10.4芯片在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性非常高。

（8）ONT測序與SMRT測序的CpG甲基化檢測比較

研究以50個(gè)oxBS樣本作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對50個(gè)SMRT測序樣本、50個(gè)ONT測序樣本（分別使用R9.4和R10.4芯片）的CpG甲基化檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。研究對所有樣本的平均5-mCpG率進(jìn)行分析，并比較所有五種方法（SMRT、R9.4-Guppy、R10.4-Guppy、R9.4-Nanopolish和oxBS）之間的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）以及5-mCpG率與oxBS之間的平均絕對差異（MAD）（表1A）。

表1：不同測序技術(shù)在CpG甲基化檢測中的一致性和準(zhǔn)確性比較

(A) APC比較結(jié)果展示在主對角線以下，MMAD比較結(jié)果展示在主對角線以上。

(B) 基于所有CpG、序列變異周圍CpG或暗區(qū)CpG位點(diǎn)的APC比較分析。

結(jié)果顯示，Guppy R10.4和Guppy R9.4在與oxBS數(shù)據(jù)的比較中表現(xiàn)最佳，其平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）最高，分別為0.97845和0.97256。表明Guppy在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性最高，能夠最接近oxBS測序的參考標(biāo)準(zhǔn)。研究還分析了不同測序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。所有測序技術(shù)均能準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)oxBS測序觀察到的CpG甲基化率的雙峰分布，Guppy R10.4的分布與oxBS測序結(jié)果最為接近，表明其在極端甲基化狀態(tài)下的檢測更為準(zhǔn)確。

此外，CpG周圍的序列變異會(huì)在oxBS中引入比對偏倚，導(dǎo)致甲基化檢測不準(zhǔn)確和APC降低（表1B）。因此對于Guppy和PacBio而言，序列變異周圍CpG位點(diǎn)的重要性較低。所有長讀長測序技術(shù)都使用特定序列背景和與參考基因組的比較來檢測CpG甲基化狀態(tài)，因此可以過濾那些序列變異周圍的CpG位點(diǎn)。

（9）5-mCpG率的分布

研究分析了不同測序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，所有測序技術(shù)在CpG甲基化率的分布上表現(xiàn)出預(yù)期的雙峰分布，但在完全甲基化和完全未甲基化狀態(tài)下的分布略有差異。Guppy R10.4測序結(jié)果與oxBS測序結(jié)果最為接近，而SMRT測序和Guppy R9.4測序結(jié)果則在極端甲基化狀態(tài)下表現(xiàn)出一定的偏倚。這一結(jié)果表明，不同測序技術(shù)在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點(diǎn)時(shí)可能存在差異，研究者在選擇測序技術(shù)時(shí)需要考慮這些因素。

圖3：不同方法檢測CpG甲基化的比較。

A. 在oxBS、Guppy R9.4和R10.4中，CpG甲基化率（0-1）在個(gè)體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。

B. 在oxBS、PacBio和Nanopore中，CpG甲基化率（0-1）在個(gè)體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。

C. 全血中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的CpG甲基化率在50bp范圍內(nèi)平均值。

D. 每種方法檢測到的CpG位點(diǎn)數(shù)量。Nanopolish統(tǒng)計(jì)每個(gè)CpG單元的所有CpG位點(diǎn)。

（10）功能區(qū)域的5-mCpG分布

為了研究生物學(xué)背景對甲基化檢測準(zhǔn)確性的作用，研究人員分析了全血中表達(dá)基因的TSS處50bp以內(nèi)的平均5-mCpG率。所有甲基化檢測方法都高度匹配oxBS測序樣本中的甲基化模式，表明在TSS區(qū)域內(nèi)甲基化缺失（圖3C）。其中PacBio和Guppy R9.4在TSS處顯示出更高的CpG甲基化率，而在TSS之外則顯示出低甲基化率，這與這兩種方法的甲基化分布輕微偏移一致（圖3A、B）。而Guppy R10.4測序結(jié)果更接近于oxBS中的TSS甲基化水平（圖3C）。表明其在功能區(qū)域的甲基化檢測上具有高準(zhǔn)確性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Guppy R10.4測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用潛力，特別是在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞分化機(jī)制研究中。

（11）長讀長測序比oxBS測序檢測到更多的CpG位點(diǎn)數(shù)量

研究發(fā)現(xiàn)，長讀長測序技術(shù)在檢測CpG位點(diǎn)數(shù)量上優(yōu)于oxBS測序。Nanopore測序和SMRT測序平均每個(gè)樣本檢測到約27M CpG位點(diǎn)（Guppy R9.4=27,467,383個(gè)CpG位點(diǎn)，Guppy R10.4=27369144個(gè)CpG位點(diǎn)，PacBio=26,739,539個(gè)CpG位點(diǎn)，Nanopolish=26,487,587個(gè)CpG位點(diǎn)，分布在22,058,476個(gè)CpG單元中），而oxBS測序僅檢測到約26M CpG位點(diǎn)（圖3D）。這一結(jié)果表明，長讀長測序技術(shù)在CpG甲基化檢測上具有更高的分辨率和更全面的覆蓋范圍，能夠?yàn)檠芯空咛峁└S富的表觀遺傳學(xué)信息。這一優(yōu)勢在研究復(fù)雜基因組區(qū)域和稀有甲基化中尤為顯著。

討論和啟示

本研究通過大規(guī)模樣本分析，揭示了長讀長測序技術(shù)在CpG甲基化檢測中的優(yōu)勢和局限性。研究揭示了測序深度、鏈偏倚、序列背景等因素對甲基化檢測的準(zhǔn)確性有顯著影響。同時(shí)，長讀長測序技術(shù)在檢測CpG甲基化方面具有顯著優(yōu)勢，尤其是在無需化學(xué)處理DNA的情況下直接檢測甲基化修飾的能力。最新的R10.4芯片技術(shù)，通過降低鏈偏倚和提高檢測準(zhǔn)確性，進(jìn)一步提升了ONT測序在甲基化檢測中的性能。未來的研究可以利用這些技術(shù)優(yōu)勢，深入探索基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化以及疾病發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域的表觀遺傳學(xué)變化。

關(guān)于易基因ONT全基因組甲基化測序服務(wù)

涵蓋人類/大鼠/小鼠等哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、植物等全物種

DNA甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的核心機(jī)制，通過不改變DNA序列的方式影響基因功能，在發(fā)育、疾病等生命過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Oxford Nanopore Technologies（ONT）推出的三代全基因組甲基化測序技術(shù)，基于納米孔電信號實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時(shí)檢測，無需化學(xué)處理即可同步解析5mC和6mA修飾。從R9到R10芯片的升級顯著提升了技術(shù)性能,已成功應(yīng)用于人類疾病診斷、作物表觀育種和微生物-噬菌體互作研究等。該技術(shù)為揭示跨物種表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了強(qiáng)大工具，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和合成生物學(xué)發(fā)展。

ONT R10芯片技術(shù)核心原理與創(chuàng)新優(yōu)勢如下：

1. 納米孔電信號識(shí)別技術(shù) DNA雙鏈通過馬達(dá)蛋白解旋后，單鏈以恒定速率通過R10納米孔。R10芯片采用雙讀取頭設(shè)計(jì)，可同時(shí)捕獲同一堿基的兩次電信號，顯著提升甲基化位點(diǎn)的識(shí)別精度（單堿基分辨率達(dá)99.8%）。甲基化修飾（如5mC、6mA）會(huì)改變堿基空間構(gòu)象，導(dǎo)致特征性電信號偏移，通過遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RNN）算法實(shí)時(shí)解析信號差異，直接判定修飾位點(diǎn)。
2. R10芯片的技術(shù)突破

• 準(zhǔn)確性提升：R10芯片的測序一致性準(zhǔn)確率>99.9%，在CpG位點(diǎn)甲基化檢測中與Illumina BS-seq的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.95（p＜0.001），尤其在低甲基化區(qū)域（＜20%）表現(xiàn)更優(yōu)。
• 讀長優(yōu)化：支持平均讀長＞50 kb，可跨越高度重復(fù)序列（如著絲粒、轉(zhuǎn)座子），解決傳統(tǒng)短讀長測序的組裝缺口問題。
• 修飾兼容性：單次運(yùn)行同步檢測5mC、6mA、5hmC等12種表觀修飾，無需亞硫酸鹽處理或抗體富集，避免DNA降解。

 

ONT全基因組甲基化測序原理示意圖

應(yīng)用場景

疾病研究與診斷：研究疾病中基因甲基化模式及變化，探索疾病發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制。

微生物學(xué)研究：研究細(xì)菌甲基化修飾，了解其在基因表達(dá)調(diào)控和病原性中的作用以及噬菌體與宿主相互作用。

進(jìn)化與生態(tài)學(xué)研究：物種間甲基化比較，研究進(jìn)化關(guān)系和生態(tài)適應(yīng)性；分析微生物在不同環(huán)境條件下的甲基化變化，研究其適應(yīng)機(jī)制。

法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：利用甲基化模式的個(gè)體差異，進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。

農(nóng)業(yè)與植物研究：研究作物在不同環(huán)境條件下的甲基化變化，指導(dǎo)作物改良育種或應(yīng)急響應(yīng)機(jī)制。

藥物研發(fā)與毒理學(xué)：通過甲基化分析揭示與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因和通路；研究藥物和環(huán)境毒素對基因甲基化的影響，評估其毒性。

參考文獻(xiàn)：

Sigurpalsdottir, B.D., Stefansson, O.A., Holley, G. et al. A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes. Genome Biol 25, 69 (2024). Doi：10.1186/s13059-024-03207-9

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