易基因：多組學分析揭示壞死性小腸結腸炎(NEC)的新型DNA甲基化調控生物標志物及發病機制：項目文章

大家好，這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。

近日，南方醫科大學第一臨床醫學院田博聞博士等為第一作者，廣州市婦女兒童醫療中心Chaoting Lan、夏慧敏教授、鐘微教授為共同通訊作者在《Inflammation》期刊發表了題為《Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers》的科研成果，研究通過多組學分析鑒定出壞死性小腸結腸炎（Necrotizing Enterocolitis, NEC）腸道組織中的新型甲基化調控生物標志物。研究首先分析了NEC患者回腸和結腸組織的DNA甲基化和轉錄組數據集，鑒定出多個甲基化相關差異基因（Methylation-Related Differentially Expressed Genes, MrDEGs），并通過單細胞數據和靶基因甲基化測序（Targeted Bisulfite Sequencing, TBS）技術驗證這些基因在NEC中的潛在診斷價值。深圳易基因為本研究提供靶基因甲基化測序（TBS）驗證技術服務。

標題：Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers（壞死性小腸結腸炎的表觀遺傳學見解：揭示甲基化調控的生物標志物）

發表時間：2025年2月

發表期刊：Inflammation

影響因子：IF5/Q2

技術平臺：靶基因甲基化測序（TBS）（易基因金牌技術）

壞死性小腸結腸炎（NEC）是一種多因素引起的胃腸道疾病，在早產兒中具有較高的發病率和死亡率。本研究旨在通過多組學分析，鑒定出NEC腸道組織中的新型甲基化調控生物標志物。研究首先分析了NEC患者回腸和結腸組織的DNA甲基化和轉錄組數據集，揭示了啟動子區域的甲基化水平與轉錄水平呈負相關，進而鑒定出甲基化相關差異基因（MrDEGs），這些基因包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、UNC93A和IL22RA1。單細胞數據顯示，這些MrDEGs主要位于腸道組織的腸道上皮區域。通過靶基因甲基化測序（TBS）和實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）驗證這些MrDEGs，研究人員成功鑒定并驗證了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP基因主要在腸道上皮絨毛細胞中表達。通過基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示這些基因主要參與NEC中T細胞分化和抑制腸道炎癥的病理過程。本研究加深了對NEC發病機制的理解，并可能推動NEC預測和診斷新的精準醫療方法發展。

易小結

本研究通過多組學分析，成功鑒定并驗證了NEC腸道組織中的新型甲基化調控生物標志物，特別是利用靶基因甲基化測序（TBS）技術對下游驗證靶基因的甲基化水平進行高精度檢測，揭示了這些基因在NEC病理過程中的潛在調控機制，為NEC的早期診斷和精準醫療提供了新的方向。

易基因提供的TBS技術不僅能夠精準鑒定甲基化位點，還能與轉錄組等數據相結合，深入分析基因表達的調控機制。這種技術在表觀基因組學研究中具有廣泛的應用前景，尤其是在疾病標志物的發現和驗證方面。易基因提供全面的表觀基因組技術解決方案，包括但不限于TBS、全基因組甲基化測序（WGBS/MeDIP-seq/EM-seq）、簡化基因組甲基化測序（RRBS/dRRBS/XRBS）及多組學測序技術服務，為研究人員提供了從基礎研究到臨床應用的完整工具鏈。

研究方法

樣本收集：共收集16份腸道組織樣本，包括8份NEC患者的回腸組織樣本和8份對照組樣本。

數據來源：從GEO數據庫中收集NEC的基因表達和DNA甲基化數據集，包括GSE212913（回腸）、GSE212997（結腸）和GSE46619（結腸和回腸）。單細胞數據來自Adi Egozi團隊研究。

DNA甲基化數據分析：差異甲基化區域（DMRs）分析，并通過UCSC數據庫進行基因組注釋。

轉錄組數據分析：篩選差異表達基因（DEGs），并進行基因集富集分析（GSEA）。

單細胞數據分析：單細胞數據分析，過濾低質量細胞-基因，并進行UMAP降維分群。

免疫浸潤分析：分析免疫細胞浸潤情況。

靶基因甲基化測序（TBS）：對NEC患者和對照組回腸組織樣本進行TBS驗證，檢測靶基因甲基化水平。

RT-qPCR：驗證靶基因的RNA表達水平。

免疫熒光染色分析：檢測NEC和對照組腸道組織中IL22RA1基因的表達差異。

圖1：本研究分析流程

結果圖形

（1）結腸和回腸NEC病變中的DNA甲基化特征

研究發現，NEC患者的結腸和回腸組織中普遍存在高甲基化現象。在回腸中，共有357個區域的甲基化水平發生變化，其中262個區域甲基化水平增加，95個區域甲基化水平降低。結腸中甲基化水平變化的區域有1550個，其中994個區域甲基化水平增加，556個區域甲基化水平降低。甲基化區域主要位于啟動子區域，結腸中啟動子區域甲基化比例為45%（702/1550），回腸中為34.35%（123/357）。這些結果表明，NEC組織的高甲基化可能通過沉默下游基因表達介導疾病發生發展。

圖2：GSE212997和GSE212913數據集中的人NEC中差異甲基化區域及GSE46619 數據集中人NEC 中差異表達基因。

a-b. 人NEC組和對照組（CTRL）樣本中DMRs散點圖。橫軸表示NEC和CTRL的平均甲基化水平，縱軸表示兩組甲基化水平差異。紅色點代表顯著上調的區域，藍色點表示顯著下調的區域。

c-d. 不同區域（啟動子、外顯子、內含子、基因間區、3’UTR 和遠端基因間區）DMRs 比例扇形圖。

e. 與NEC標志基因相關DEGs火山圖。

f. DEGs 的GSEA分析。

g. 免疫浸潤分析預測免疫細胞比例箱線圖。縱軸表示免疫細胞的富集水平，橫軸表示每種免疫細胞名稱。

（2）NEC轉錄組數據的免疫學特征

通過對GSE46619轉錄組數據集分析，揭示了NEC樣本中共有1,693個差異表達基因（DEGs），其中499個上調基因和1,194個下調基因。這些基因包括已知的NEC標志基因，如TLR4、CXCL8、PLA2G7、HBEGF和FABP2。通過GSEA分析揭示了與NEC相關的基因集主要參與免疫炎癥通路，如NF-κB信號通路、IL-17信號通路和TNF信號通路。免疫浸潤分析顯示，NEC組中激活的樹突狀細胞、效應記憶CD4+ T細胞、未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells）、巨噬細胞（macrophages）、肥大細胞（mast cells）、髓源性抑制細胞(MDSCs)、NKT細胞(Natural killer T cell)、中性粒細胞（neutrophils,）、漿細胞樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells）、調節性T細胞、T濾泡輔助細胞、Th1細胞和Th17細胞數量與對照組存在顯著差異（圖2g）。這些結果表明，免疫細胞過度激活在NEC的發生中發揮重要作用。

（3）NEC中MrDEG的多組學聯合分析

研究通過結合DNA甲基化和轉錄組分析結果篩選出9個甲基化調控基因，包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、IL22RA1和UNC93A。這些基因在NEC組織中DNA甲基化水平升高和RNA表達水平降低。單細胞數據分析顯示，這些基因主要在腸道上皮細胞中表達，尤其是腸絨毛細胞。通過靶基因甲基化測序（TBS）和RT-qPCR驗證，驗證了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP這4個基因的甲基化水平與RNA表達水平呈負相關，表明其可能是NEC的潛在生物標志物。

圖3：篩選甲基化相關差異基因（MrDEGs）并分析其在NEC單細胞數據集中的定位。

a. 不同腸道部位甲基化相關基因上調或下調基因UpSet圖。

b-c. ADAP1/GUCA2A的甲基化區域比對到到基因組上的UCSC基因組瀏覽器圖。黑色區域表示高甲基化位置，條形圖顯示NEC組與對照組的平均甲基化水平。

d. 按細胞類型分類的單細胞圖譜。

e. 按疾病分類的單細胞圖。

f. 點圖顯示按細胞類型分類的MrDEGs。

g. 由MrDEGs著色的UMAP圖。

（4）驗證MrDEG DNA甲基化和轉錄組水平

研究通過TBS技術對NEC患者和對照組的回腸組織樣本進行甲基化水平檢測，檢測結果揭示ADAP1、GUCA2A、IL22RA1、MISP、UNC93A和USH1C基因在NEC組織中的甲基化水平顯著升高。RT-qPCR結果表明，這些基因在NEC組織中的RNA表達水平顯著降低。這些結果進一步驗證這些基因在NEC中的甲基化調控作用。

圖4：在人組織樣本中驗證甲基化相關差異基因（MrDEGs）的甲基化水平和RNA表達。

MrDEGs甲基化水平可視化。熱圖顯示CpG島的甲基化水平，右側指示該CpG島測序的起始位置。
顯示MrDEGs甲基化水平差異直方圖。
NEC患者中甲基化相關基因的mRNA表達水平。

（5）MrDEG 功能預測

通過單細胞數據分析結果揭示了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP主要在腸道上皮細胞的腸絨毛細胞中表達。HE染色結果顯示，NEC組織的腸絨毛結構嚴重受損。通過GSEA分析揭示這些基因的低表達與TNF信號通路、NF-κB信號通路、IL-17信號通路和Toll樣受體信號通路的過度激活有關。這些通路過度激活可能導致腸道細胞炎癥反應加劇，從而加重NEC病理過程。

圖5：通過單細胞數據和單基因GSEA分析預測MrDEGs定位和作用。

按細胞類型分類的腸上皮細胞簇的重新聚類圖譜。
按疾病分類的腸上皮細胞簇的重新聚類圖譜。
由MrDEGs著色的UMAP圖。
H&E染色實驗分析NEC組和對照組腸絨毛結構的病理變化，

e-h. MrDEGs組中的免疫相關基因集。

討論和啟示

本研究通過多組學分析，揭示了NEC中DNA甲基化的調控機制，并鑒定出多個潛在的甲基化調控生物標志物。這些生物標志物在NEC的早期診斷和精準醫療中具有重要的應用前景。此外，研究還探討了這些生物標志物在NEC病理過程中的作用機制，為未來開發新的治療策略提供了理論基礎。未來的研究需要在更大的臨床樣本中驗證這些發現，并進一步探索這些生物標志物在NEC發病機制中的具體作用。

圖6：甲基化相關差異基因（MrDEGs）篩選過程及其作用機制示意圖。

靶基因甲基化測序分析（TBS）在本研究中發揮了重要作用。TBS技術通過檢測靶基因甲基化水平，為研究NEC中的DNA甲基化調控機制提供了直接證據。TBS技術的單堿基分辨率和高靈敏度使其能夠準確檢測到NEC組織中基因啟動子區域的甲基化變化，從而揭示了這些基因在NEC中的潛在調控作用。未來類似標志物篩選驗證研究中，TBS技術可以作為一種重要的工具，用于驗證和篩選潛在的甲基化調控生物標志物，為疾病的早期診斷和治療提供新思路。

易基因：DNA甲基化研究基本思路

DNA甲基化一般遵循四個步驟：

首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。

其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。

再次，進行多組學聯合分析，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網絡關聯等。

最后，對篩選出的目標區域DNA甲基化進行驗證，通常采用靶基因重亞硫酸鹽測序（Target-BS）。

關于易基因靶基因DNA甲基化測序（Target-BS）

對目標基因/CpG 位點甲基化檢測，建立靈活的靶向甲基化測序技術。易基因建立的靶基因甲基化高通量測序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS/TBS）是針對已有目標基因panel組合，運用易基因自主研發的甲基化特異性多重PCR引物設計軟件，對亞硫酸鹽轉化后的目標基因多重擴增，建庫后進行超高深度（1000X以上）甲基化精準檢測。

應用方向：

Target-BS廣泛用于已知位點的甲基化Biomarker篩選、驗證及臨床轉化應用

后續目的基因的甲基化驗證

技術優勢：

多基因多重擴增，檢測通量高；
超高深度亞硫酸鹽甲基化測序，相對于傳統BSP克隆測序，檢測靈敏度、準確性高，可準確檢測到樣本中低于1%的甲基化水平；
樣本需求量低，20ng基因組DNA可實現多基因擴增；
適用范圍廣，對基因組DNA、FFPE樣本、游離cfDNA等樣本均適用；
檢測費用顯著低于現有技術、快周期、超高性價比。

參考文獻：

Tian B, Xu X, Li L, Tian Y, Liu Y, Mu Y, Lu J, Song K, Lv J, He Q, Zhong W, Xia H, Lan C. Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers. Inflammation. 2024 May 30. doi: 10.1007/s10753-024-02054-x.